軍團菌（legionella）是一種常見的水源性致病微生物，廣泛存在于各種水環(huán)境中，特別是在包括飲用水在內(nèi)的人工水體中。目前空調(diào)冷卻水、噴泉水等非飲用水中軍團菌污染問題已引起各國研究者的廣泛關(guān)注，而飲用水中軍團菌污染的相關(guān)研究較少。但近年來飲用水系統(tǒng)被軍團菌污染事件時有發(fā)生，特別是2020年受新冠疫情的影響，多數(shù)建筑長期封閉導(dǎo)致供水系統(tǒng)長時間水流停滯，為軍團菌的生長繁殖提供有利條件。2020年5至7月美國有報道稱，包括美國疾控中心多處辦公樓在內(nèi)的供水系統(tǒng)、度假酒店的自來水以及大學(xué)校園的建筑供水均檢出軍團菌。感染軍團菌可引起嚴重的呼吸道傳染病，其中嗜肺軍團菌（legionella pneumophila，lp)與人類疾病關(guān)系最為密切。目前我國現(xiàn)行《生活飲用水衛(wèi)生標準》（gb 5749-2006）未對軍團菌指標提出控制要求，現(xiàn)有的微生物指標也無法準確提示軍團菌污染水平。但美國環(huán)保署（us-epa）2001年頒布的《國家飲用水水質(zhì)標準》（epa 816-f-09-004）中國家一級飲用水規(guī)程規(guī)定軍團菌最大污染水平的控制目標為零。世界衛(wèi)生組織（who）2011年發(fā)布的《飲用水水質(zhì)準則》第四版也已將軍團菌列入12種水源性病原體之一，明確其衛(wèi)生學(xué)意義重大。

分離培養(yǎng)法是目前國際通用檢測軍團菌的“金標準”，適用于各種環(huán)境水體。但也有研究者提出該方法存在操作繁瑣，檢測周期較長，易受雜菌干擾等缺陷。近些年出現(xiàn)了多種新的嗜肺軍團菌定量檢測方法。其中，酶底物法作為一種同時適用于飲用水和非飲用水的嗜肺軍團菌檢測方法備受關(guān)注。北美、歐洲、日本等國家相繼對該方法進行了能力驗證及應(yīng)用，普遍認為酶底物法具有操作簡單、靈敏性高的特點，可用于檢測飲用水中嗜肺軍團菌。目前，我國還未對該方法在檢測飲用水中嗜肺軍團菌的可行性進行研究?；诖?，本研究擬通過加標試驗對酶底物法檢測飲用水中嗜肺軍團菌最適宜的培養(yǎng)條件進行探索，并運用該方法對飲用水水樣進行檢測分析，為進一步探索適用于飲用水中嗜肺軍團菌的檢測方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

試驗所用的嗜肺軍團菌質(zhì)控樣品nctc 11192（atcc 33152）購置于美國愛德士生物科技公司（idexx），單只質(zhì)控樣真值為1 604±335 mpn/100ml。

1.2 儀器和試劑

程控定量封口機（idexx），恒溫培養(yǎng)箱，渦旋振蕩器，生物安全柜，離心機，水浴鍋，移液槍；酶底物培養(yǎng)基、定量盤（idexx），乳膠凝集試劑盒（oxoid），軍團菌診斷血清試劑1-15型（天津生物芯片），bcye和bcye?cye培養(yǎng)基（陸橋），qiaamp dna mini kit試劑盒（qiagen）。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 方法原理

酶底物法是一種以細菌酶檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，基于最可能數(shù)（most probable number, mpn）方法的定量檢測方法。嗜肺軍團菌利用酶底物試劑中豐富的氨基酸、維生素和其他營養(yǎng)成分迅速生長繁殖，同時會利用額外添加的酶底物反應(yīng)生成一種棕色的指示物使溶液顯褐色或者渾濁。

1.3.2 培養(yǎng)條件設(shè)置

本研究擬對培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間進行考察。根據(jù)分離培養(yǎng)法中軍團菌最適培養(yǎng)溫度為36±1℃以及酶底物法中建議的飲用水中嗜肺軍團菌培養(yǎng)溫度為39℃，本研究將培養(yǎng)溫度設(shè)定為5組：33℃、36℃、39℃、42℃、45℃，每個溫度條件設(shè)9個平行樣，并在培養(yǎng)箱中放入一個裝有足量水的托盤，以保持培養(yǎng)箱中濕度適宜。培養(yǎng)時間設(shè)定為11 d，樣品在培養(yǎng)過程中每隔24h觀察記錄96孔定量盤的顏色和濁度變化，從第1 d到第11 d持續(xù)觀察。

1.3.3 培養(yǎng)方法

嗜肺軍團菌質(zhì)控樣品用適量無菌去離子水稀釋，配制成高、中、低（321±67 mpn/100ml、64±13 mpn/100ml、8±2 mpn/100ml）三種不同濃度的100ml菌懸液作為陽性待測樣品。在待測樣品中加入酶底物培養(yǎng)基，振蕩混勻并倒入96孔定量盤中，輕拍定量盤排出空氣后放入程控定量封口機中封口，最后將定量盤紙片一面朝下，在33℃、36℃、39℃、42℃、45℃溫度條件下培養(yǎng)。同時，用無菌水代替陽性待測樣品，其他操作步驟同上述一致，設(shè)為陰性對照。

1.3.4 結(jié)果判讀

相對陰性對照而言，無論渾濁與否，任何顯褐色的跡象均認為嗜肺軍團菌陽性；相對陰性對照而言，無論是否顯褐色，濁度大于陰性對照即認為嗜肺軍團菌陽性；如顏色與濁度方面與陰性對照無差異，認為嗜肺軍團菌陰性。根據(jù)以上標準判讀結(jié)果，數(shù)出顯陽性的大小孔格數(shù)，對照mpn表得到嗜肺軍團菌濃度（mpn/100ml）。

1.4 飲用水水樣檢測

1.4.1 水樣的采集和檢測

（1）采集水樣：于2020年6月隨機無菌采集北方某城市飲用水水樣，每份樣品100ml。水樣低溫運輸回實驗室后室溫儲存，3 d內(nèi)進行酶底物法檢測。

（2）培養(yǎng)方法：用水硬度測試條測定水樣的硬度。根據(jù)水的硬度進行預(yù)處理：0~2個顯色條呈陽性為低硬度，需向100ml水樣中加入酶底物補充劑0.33ml，3~4個顯色條呈陽性為高硬度，需向100ml水樣中加入酶底物補充劑1ml。加入酶底物培養(yǎng)基到混合液中，振蕩混勻，倒盤封口。按照條件探索試驗確定的最適培養(yǎng)條件培養(yǎng)，同時設(shè)置陰性對照。結(jié)果判讀同1.3.4。

1.4.2 陽性孔確證試驗

本研究同時采用血清凝集和16s rdna測序兩種方法對陽性結(jié)果進行確證實驗。

（1）血清凝集法：用接種環(huán)取10 μl陽性菌懸液涂布于bcye和bcye-cye培養(yǎng)基上，在co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)2~4 d。對在bcye上生長、bcye-cye上無生長的菌落進行血清凝集型別鑒定，可分出血清1-15型。

（2）16s rdna序列分析：dna提取步驟按照qiaamp dna mini kit試劑盒說明書進行；16s rdna引物信息：引物f為5′-gttaagtcccgcaacga-3′；引物r為5′-ccaacagctagttgacatcg-3′，由某基因科技有限公司合成。pcr體系：1 μl模板，15 μl super mix，1 μl primer f（10p），1 μl primer r（10p），12 μl ddh2o，共30 μl。反應(yīng)程序：96℃預(yù)變形5min；96℃變性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后，72℃延伸10min。擴增后取3 μl pcr產(chǎn)物進行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測并觀察條帶性狀；pcr產(chǎn)物純化按照磁珠純化標準操作流程操作；純化后的pcr產(chǎn)物由某基因科技有限公司進行16s rdna測序分析。

1.5 質(zhì)量控制

atcc 33152為本次研究陽性對照質(zhì)控菌株。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用spss19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。嗜肺軍團菌加標回收試驗結(jié)果的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)溫度

加標試驗結(jié)果顯示，當培養(yǎng)溫度為33℃時，嗜肺軍團菌加標回收率在21.3%~75%；當培養(yǎng)溫度為36℃時，嗜肺軍團菌最大檢出濃度接近加標濃度，加標回收率在89.5%~105%；當培養(yǎng)溫度為39℃時，嗜肺軍團菌最大檢出濃度與加標濃度基本一致，加標回收率在98.4%~108.8%；當培養(yǎng)溫度為42℃時，嗜肺軍團菌最大檢出濃度偏低，加標回收率在25.8%~51.4%；當培養(yǎng)溫度為45℃時，嗜肺軍團菌最大檢出濃度明顯偏低，加標回收率<34.6%。采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示f=17.90，p<0.05，認為5組數(shù)據(jù)有顯著性差異，具體數(shù)據(jù)見表1。單因素方差分析兩兩比較結(jié)果顯示，39℃組與36℃組數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.576）。

表1 不同培養(yǎng)溫度嗜肺軍團菌最大檢出濃度（mpn/100ml）和加標回收率（%）

注:經(jīng)單因素方差分析，p<0.05;

2.1.2 培養(yǎng)時間

由圖1a可知，嗜肺軍團菌陽性樣品在高濃度時，當培養(yǎng)溫度為45℃、42 ℃、39 ℃、36 ℃時，第4 d開始出現(xiàn)陽性現(xiàn)象，45℃、42 ℃、39 ℃ 時第7 d結(jié)果趨于穩(wěn)定，36 ℃條件下第8 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當培養(yǎng)溫度為33℃時，第6 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，直到第11 d未觀察到連續(xù)穩(wěn)定結(jié)果即未達到最大檢出濃度。由圖1b可知，嗜肺軍團菌陽性樣品在中濃度，培養(yǎng)溫度為42 ℃、39℃、36 ℃時，第4 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，并分別在第6 d、第7 d、第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當培養(yǎng)溫度為45℃、33℃時，第5 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，并分別在第6 d和第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。由圖1c可知，嗜肺軍團菌陽性樣品在低濃度，培養(yǎng)溫度為45℃ 時，未觀察到陽性現(xiàn)象，分析可能是溫度過高導(dǎo)致嗜肺軍團菌死亡或者活性消失；當培養(yǎng)溫度為42℃時，在第5 d出現(xiàn)陽性現(xiàn)象，第6 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當培養(yǎng)溫度為39℃、36℃時，第4 d開始觀察到陽性現(xiàn)象，分別在第6 d和第9 d結(jié)果趨于穩(wěn)定；當培養(yǎng)溫度為33℃時，在第6 d觀察到陽性現(xiàn)象，第10 d結(jié)果趨于穩(wěn)定。

圖1 不同濃度嗜肺軍團菌隨時間變化生長曲線

2.2 飲用水水樣檢測

本研究采用酶底物法對采集的飲用水水樣進行了嗜肺軍團菌檢測，共檢出嗜肺軍團菌陽性樣品4份，分離獲得4株嗜肺軍團菌，通過乳膠凝集血清學(xué)分型分別為1型、15型、7型、10型嗜肺軍團菌；另外通過16s rdna測序分析對其進行菌株確證，結(jié)果顯示，分離的4株菌均屬嗜肺軍團菌，表現(xiàn)為2種基因型，命名為lp-no.1和lp-no.2。其中l(wèi)p-no.1有2株，對應(yīng)的血清型為1型和7型；lp-no.2有2株，對應(yīng)的血清型為10型和15型。根據(jù)blast結(jié)果顯示，lp-no.1株與cp048618.1 legionella pneumophila親緣關(guān)系最近，相似性為100%；lp-no.2與lr134380.1 legionella pneumophila subsp. pascullei親緣關(guān)系最近，相似性為99?77%?，F(xiàn)基于16s rdna測序結(jié)果建立的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 基于16s rdna測序結(jié)果的嗜肺軍團菌系統(tǒng)發(fā)育樹

培養(yǎng)溫度是影響嗜肺軍團菌生長繁殖的重要因素，一般認為軍團菌可在20~50℃的水溫環(huán)境下生存，最佳生存溫度為25~42 ℃。研究表明，當酶底物法培養(yǎng)溫度高至42℃以上或低至33℃以下時，嗜肺軍團菌最大檢出濃度均明顯低于理論濃度的50%，即加標回收率均低于50%，說明高溫可以殺滅嗜肺軍團菌或使其活性喪失，而溫度過低又會導(dǎo)致嗜肺軍團菌活性降低，使顯色反應(yīng)延遲或不發(fā)生。本研究中，當培養(yǎng)溫度為39℃和36℃時，嗜肺軍團菌最大檢出濃度值與理論濃度值基本一致，即均可達到較高的加標回收率，為較適宜的培養(yǎng)溫度，且從圖2的指數(shù)增長曲線可以看出39℃時嗜肺軍團菌最大檢出濃度比36℃時更接近理論濃度值，但未發(fā)現(xiàn)兩者存在統(tǒng)計學(xué)差異。

培養(yǎng)時間對酶底物法具有顯著的影響。相同溫度條件下，隨著培養(yǎng)時間的增加，嗜肺軍團菌檢出率增高。當溫度≥39℃時指數(shù)增長階段集中在第4~7 d，當溫度＜39℃時指數(shù)增長階段集中在第4~10 d。結(jié)合培養(yǎng)溫度的研究結(jié)果，重點比較39℃和36℃培養(yǎng)溫度下嗜肺軍團菌的生長趨勢。結(jié)果顯示，當培養(yǎng)溫度為39℃時，高中低濃度陽性樣品均能穩(wěn)定在第4 d開始出現(xiàn)陽性顯色現(xiàn)象，并在第6 d或第7 d達到最大檢出濃度；當培養(yǎng)溫度為36℃時，高中低濃度陽性樣品均在第4 d開始出現(xiàn)陽性顯色現(xiàn)象，并在第8 d或第9 d達到最大檢出濃度。綜合考慮培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間，在保證高回收率的同時盡可能縮短培養(yǎng)周期，本研究認為酶底物法在39℃條件下，選擇7 d作為培養(yǎng)時間，嗜肺軍團菌的檢出效果最好。

3.2 方法的特異性

本研究通過酶底物法對北方某城市的部分飲用水水樣進行檢測，共檢出嗜肺軍團菌陽性4份，通過血清分型試驗和16s rdna序列分析對陽性樣品進行確證，兩種確證方法結(jié)果一致，4份陽性樣品均為嗜肺軍團菌。結(jié)果表明，本研究通過酶底物法檢測獲得的4份嗜肺軍團菌陽性水樣特異性為100%，這與spies k等人的研究結(jié)果相同。